一、实验目的

学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白)，为染色准备实验材料。

三、实验材料与器材

1、材料

293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、dmem培养基、链mei素/青mei素(双抗)、FCS(小牛血清)、PBS(盐缓冲溶液)、胰酶/EDTA消化液、转染试剂(TransFast)

2、器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD

四、实验步骤

1、细胞传代

(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞*从壁上脱落下来为止。

(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。

(5)用Tip头多次吹吸，使细胞*分散开。

(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

(8)将合适体积*培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。

2、细胞转染

(1)转染试剂的准备

A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在-20摄氏度保存，使用前还需震荡，。

(2)选择合适的混合比例(1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

(3)将混合液在室温放置10—15分钟。

(4)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

(5)加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

(6)到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入*培养基继续培养24-48小时。

3、第二次细胞传代

(1) 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

(2) 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

(3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

五、研究进展

1、转染技术

上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)的转染性能，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。

转染试剂

2、转染效率

线型PEI(LinePEI,LPEI)与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(BranchedPEI,BPEI)要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但zui近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。

GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

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