1. 为什么做靶向测序
高通量测序技术的广泛应用，特别是二代测序的普及，使得科研人员能够更容易更快速地获取基因组信息。然而，一方面，获取完整基因组仍然费用较高，特别是进行大量样本检测时。另一方面，如何发掘隐藏在海量测序数据背后的意义仍是短期内无法解决的问题。所以现在就说，我们进入了个人基因组时代还为时尚早。
在研究中，大多数的科研人员其实并不需要全部的基因组序列，也难以有效利用如此巨大的数据集。科研人员在很多情况下更需要高度的分析，例如检测罕见疾病携带的变异，或是确保检测的准确性和重复性。此外，在的医学中，当人们只关注特定的基因或基因组区域时，受时间、费用和数据存储等因素限制，对特定基因集（几十到几百个热点基因）或是基因组的特定区域进行测序是更为合理的选择。这种测序策略即为靶向测序。靶向测序能更经济地实现大量样本的检测，实现远高于基因组测序的测序深度和灵敏度，并且大幅提升突变发现能力。
2. 靶标捕获可以更简单吗
目前主流的靶向序列捕获方案主要有两种，一种基于杂交靶向富集，另一种基于多重PCR靶向富集。现有的靶向文库制备方法都不同程度的存在着均一性差、序列脱靶、操作流程繁复、操作时间长以及高昂的前期设备投入等问题。有没有新的技术可以实现更简单的靶向文库制备，又能获取更高特异性和均一性的文库？是不是能一次反应就能同时完成靶向序列的捕获和测序文库的制备，而不需要额外的实验操作？
答案是肯定的。zui近上市的VariantPro™靶向文库制备系统，是一个基于多重PCR又不同于传统多重PCR的靶向文库制备技术，这个系统实现了一步操作即完成从靶向序列捕获到测序文库制备的全过程，而整个过程中只需人工操作5分钟。这个新系统采用了两项技术：OmegaPrimer™和RelayPCR™。这两项技术又有什么过人之处？
3. *的形似Ω的引物
OmegaPrimer™是一个*不同于传统的，形似Ω的*引物。这个引物带有3个功能区，5p臂设计保证了引物稳定的结合模板，3p臂设计会双重检查结合特异性并启动聚合酶延伸，两臂之间的loop环起到间隔作用，同时又为后续文库扩增提供通用引物（common primer）杂交的序列（图1）。在OmegaPrimer™中3p臂被设计较短，因而在统计学上，将大幅降低多重PCR体系中形成可扩增引物二聚体几率。这样的设计大幅提升了引物的特异性，同时又能容忍模板出现个别碱基的突变。容忍模板出现个别碱基的突变有什么用处？这是一个非常有用的特性，考虑到在拥有30亿个碱基对的人类基因组中有600万个高等位基因频率（> 1%）的SNPs，平均每500 bp就有1个SNP，这样的引物宽容性就显得非常必要了。
图1 OmegaPrimer™含有3个功能区
4. 会自动接力的PCR
RelayPCR™（接力PCR）将一对通用引物和成百上千对（甚至更多）特异性引物（OmegaPrimer™）与基因组DNA混合在一个样品管中。运行一次多重PCR即完成从特异性捕获成百上千个靶向序列（区域）到高均一性制备测序文库的全过程。这个设计带来显著简化的工作流程。具体地，RelayPCR™可以通过控制成百上千对特异性引物（OmegaPrimer™）只在zui初靶标捕获的两个循环中发挥作用，之后会自动转换到由一对通用引物（common primer）进行的文库扩增反应。这种实验策略消除了传统多重PCR中多对特异性引物间存在的引物扩增效率差异的现象，从而确保了制备高均一性文库（图2）。在设计通用引物时，可以引入二代测序所需的引物（包括barcode），并且兼容主流的illumina和Ion Torrent测序平台。当全部PCR反应结束后，测序文库也一起制备完毕。
图2 RelayPCR™实验流程
由于反应体系中common primer的量远大于specific primer（即omegaprimer™）的量，zui初靶标捕获的两个循环结束后，体系中出现了可与common primer杂交的扩增子时，PCR反应即自动切换到由一对common primer引导的文库扩增阶段。与common primer杂交结合的序列，来自omegaprimer™的loop环。
点击观看微电影《一步法制备靶向测序文库》
5. VariantPro™表现如何
? *的文库均一性
由于VariantPro™采用了Relay-PCR™技术，限制特异性引物（OmegaPrimer™）只在zui初2个循环——靶标捕获时发挥作用，接着会自动切换到由通用引物主导的文库扩增循环，直到反应结束，从而确保了生成*均一性的文库（见图3）。
扩增子覆盖的均一性通常是由＞0.2×扩增子平均覆盖度的序列所占百分比来测定。如下图所示，VariantPro™系统制备的人类线粒体DNA文库达到> 99.1%的均一性。
图3 VariantPro™系统制备文库具有*的文库均一性
? *的重复性
样品和文库制备步骤中的误差是破坏实验重复性的一个潜在来源。这意味着实验越复杂就越可能增加实验误差的几率。VariantPro™具有极简的工作流程，因而zui大限度地降低操作引起的误差。测试实验发现，运行不同的PCR循环数或采用不同的起始DNA量，都不会显著影响测序结果的重复性（见图4，5）。
| 15 cycles | 17 cycles | 19 cycles | 21 cycles | 23 cycles | 27 cycles |
15 cycles | 1.000 | 0.992 | 0.983 | 0.951 | 0.978 | 0.932 |
17 cycles | 0.992 | 1.000 | 0.995 | 0.969 | 0.984 | 0.919 |
19 cycles | 0.983 | 0.995 | 1.000 | 0.965 | 0.980 | 0.910 |
21 cycles | 0.951 | 0.969 | 0.965 | 1.000 | 0.973 | 0.890 |
23 cycles | 0.978 | 0.984 | 0.980 | 0.973 | 1.000 | 0.944 |
27 cycles | 0.932 | 0.919 | 0.910 | 0.890 | 0.944 | 1.000 |
图4 不同PCR循环次数（15至27个循环）的相关系数分析表明，PCR循环次数不会影响文库组成。
| 1.0 ng | 2.5 ng | 5.0 ng | 7.5 ng | 10.0 ng |
1.0 ng | 1.000 | 0.991 | 0.986 | 0.978 | 0.952 |
2.5 ng | 0.991 | 1.000 | 0.979 | 0.989 | 0.973 |
5.0 ng | 0.986 | 0.979 | 1.000 | 0.984 | 0.956 |
7.5 ng | 0.978 | 0.989 | 0.984 | 1.000 | 0.984 |
10.0 ng | 0.952 | 0.973 | 0.956 | 0.984 | 1.000 |
图5 不同的模板gDNA（1.0至10.0 ng）的相关系数分析表明，反应所需模板量是灵活可变的。
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